ESTRUCTURA DE LOS ÁCIDOS NUCLÉICOS
     
Módelo de la Doble Hélica Difracción de Rayos X: ADN-B J. Watson y F. Crick

COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Miescher en 1871 aisló del núcleo de las células de pus una sustancia ácida rica en fósforo que llamó "nucleína". Un año más tarde, en 1872, aisló de la cabeza de los espermas del salmón un compuesto que denominó "protamina" y que resultó ser una sustancia ácida y otra básica. El nombre de ácido nucleico procede del de "nucleína" propuesto por Miescher.

Cuando se realiza la hidrólisis completa de los ácidos nucleicos, se obtienen tres tipos de componentes principales:

El azúcar, en el caso de los ácidos desoxirribonucleicos (ADN) es la 2-desoxi-D-ribosa y en el caso de los ácidos ribonucleicos (ARN) es la D-ribosa.

Pentosas Ácido fosfórico

Las bases nitrogenadas que forman parte de los ácidos nucleicos son de dos tipos, púricas y pirimidínicas. Las bases púricas derivadas de la purina (fusión de un anillo pirimidínico y uno de imidazol) son la Adenina (6-aminopurina) y la Guanina (2-amino-6-hidroxipurina). Las bases pirimidínicas (derivadas de la pirimidina) son la Timina (2,6-dihidroxi-5-metilpirimidina o también llamada 5-metiluracilo), Citosina (2-hidroxi-6-aminopirimidina) y Uracilo (2,6-dihidroxipirimidina). Las bases nitrogenadas que forman normalmente parte del ADN son: Adenina (A), Guanina (G), Citosina  y Timina (T). Las bases nitrogenadas que forman parte de el ARN son: Adenina (A), Guanina (G), Citosina (C) y Uracilo (U). Por tanto, la Timina es específica del ADN y el Uracilo es específico del ARN.

Bases Púricas Bases Pirimidínicas

Además de las bases nitrogenadas anteriormente descritas, se han encontrado otras bases nitrogenadas en algunos virus o formando parte de algunos tipos especiales de ARNs. Ejemplos de algunas de estas bases púricas poco corrientes son: Hipoxantina, Xantina, 2-metiladenina, 6-metil-aminopurina. Entre las bases pirimidínicas podríamos citar la 5-metilcitosina (propia del ADN) y la 5-hidroximetil citosina (HMC) que sustituye a la citosina en los fagos T-pares.

En los ARN transferentes (ARN-t) que intervienen en el proceso de traducción de proteínas se encuentran la Ribotimidina, Dihidrouridina, Seudouridina e Inosina (I).

La unión de la base nitrogenada a la pentosa recibe el nombre de nucleósido y se realiza a través del carbono 1’ de la pentosa y los nitrógenos de las posiciones 3 (pirimidinas) o 9 (purinas) de las bases nitrogenadas mediante un enlace de tipo N-glucosídico. La unión del nucleósido con el ácido fosfórico se realiza a través de un enlace de tipo éster entre el grupo OH del carbono 5’ de la pentosa y el ácido fosfórico, originando un nucleótido. Los nucleótidos son las unidades o monómeros utilizados para construir largas cadenas de polinucleótidos.

Nucleótido

Tanto los nucleótidos como los nucleósidos pueden contener como azúcar la D-ribosa (ribonucleótidos y  ribonucleósidos) o la pentosa 2-desoxi-D-ribosa (desoxirribonucleótidos y desoxirribonucleósidos).

Además, los nucleótidos pueden tener 1, 2 ó 3 grupos fosfato unidos al carbono 5’ de la pentosa, existiendo por tanto, nucleótidos 5’ monofosfato, nucleótidos 5’ difosfato y nucleótidos 5’ trifosfato. En algunos casos el ácido fosfórico se une a la pentosa por el carbono 3’, existiendo nucleótidos 3’ monofosfato, difosfato o trifosfato según el número de grupos fosfato que posea.

La terminología empleada para referirse a los nucleósidos y nucleótidos es la siguiente:

Base Nitrogenada Nucleósido Nucleótido
Adenina Adenosina Ácido Adenílico
Guanina Guanidina Ácido Guanílico
Citosina Citidina Ácido Citidílico
Timina Timidina Ácido Timidílico
Uracilo Uridina Ácido Uridílico

Los nucleótidos se unen entre si para formar largas cadenas de polinuclóetidos, esta unión entre monómeros nucleótidos se realiza mediante enlaces fosfodiéster entre los carbonos de las posiciones 3’ de un nucleótido con la 5’ del siguiente.

Polinucleótido

PROPORCIONES DE LAS BASES NITROGENADAS: REGLAS DE CHARGAFF

Al principio se pensaba que los ácidos nucleicos eran la repetición monótona de un tetranucleótido, de forma que no tenían variabilidad suficiente para ser la molécula biológica que almacenara la información. Sin embargo, Chargaff (1950) demostró que las proporciones de las bases nitrogenadas eran diferentes en los distintos organismos, aunque seguían algunas reglas. Estas reglas de Chargaff se cumplen en los organismos cuyo material hereditario es ADN de doble hélice y son las siguientes:

REGLAS DE CHARGAFF PARA ADN DE DOBLE HÉLICE

Edwin Chargaff

 

  • La proporción de Adenina (A) es igual a la de Timina (T). A = T . La relación entre Adenina y Timina es igual a la unidad (A/T = 1).

  • La proporción de Guanina (G) es igual a la de Citosina (C). G= C. La relación entre Guanina y Citosina es igual a la unidad ( G/C=1).

  • La proporción de bases púricas (A+G) es igual a la de las bases pirimidínicas (T+C). (A+G) = (T + C). La relación entre  (A+G) y (T+C) es igual a la unidad (A+G)/(T+C)=1.

  • Sin embargo, la proporción entre (A+T) y (G+C) era característica de cada organismo, pudiendo tomar por tanto, diferentes valores según la especie estudiada. Este resultado indicaba que los ácidos nucleicos no eran la repetición monótona de un tetranucleótido. Existía variabilidad en la composición de bases nitrogenadas. 

En la siguiente tabla se observan las proporciones de las bases nitrogenadas en algunos organismos.

Procedencia del ADN A G C T 5-Me-C
Timo de Bovino 28,2 21,5 21,2 27,8 1,3
Esperma de bovino 28,7 22,2 20,7 27,3 1,3
Germen de trigo 27,3 22,7 16,8 27,1 6,0
Saccharomyces 31,3 18,7 17,1 32,9 -
Escherichia coli 26,0 24,9 25,2 23,9 -
Mycobacterium tuberculosis 15,1 34,9 35,4 14,6 -
ØX174 24,3 24,5 18,2 32,3 -
T3 23,7 26,2 27,7 23,5 -
T5 30,3 19,5 19,5 30,8 -
T7 32,4 18,3   32,4 17,0 HMC
Virus ARN A G C U
Mosaico del tabaco (TMV) 29,8 25,4 18,5 26,3
Mosaico amarillo nabo 22,6 17,2 38,0 22,2
Poliomielitis 28,6 24,0 22,0 25,4
Encéfalo miocarditis del ratón 27,3 23,5 23,2 25,9
Reovirus Tipo 3 28,0 22,3 22,0 27,9
Tumor de las heridas 31,1 18,6 19,1 31,3

De la observación de la tabla anterior pueden extraerse las siguientes conclusiones:

Igualmente, en la siguiente tabla puede observarse como la proporción A+T/G+C varia de un organismo a otro.  

Organismo Tejido

A+T/G+C

Escherichia coli - 1,00
Diplococcus pneumoniae - 1,59
Mycobacterium tuberculosis - 0,42
Levadura - 1,79
Paracentrolus lividus (erizo mar) Esperma 1,85
Arenque Esperma 1,23
Rata Médula ósea 1,33
Hombre Timo 1,52
Hombre Hígado 1,53
Hombre Esperma 1,52

Por tanto, la proporción A+T/G+C es específica de cada organismo y como veremos más adelante cuando hablemos de las propiedades físico- químicas de los ácidos nucleicos, dicha proporción está relacionada con la densidad y la temperatura de fusión.

EL MODELO DE LA DOBLE HÉLICE: WATSON Y CRICK (1953)

Una vez demostrado que los ácidos nucleicos eran los portadores de la información genética, se realizaron muchos esfuerzos encaminados a determinar su estructura con exactitud. Watson y Crick (1953) fueron los primeros investigadores en proponer una estructura para los ácidos nucleicos y su labor investigadora se vio recompensada con el Premio Nobel en 1962, Premio Nobel que compartieron con M. H. F. Wilkins y que se les concedió por sus descubrimientos en relación con la estructura molecular de los ácidos nucleícos y su significación para la transmisión de la información en la materia viva.. Para realizar su trabajo emplearon dos tipos de datos ya existentes.

Francis H. C. Circk James D. Watson Maurice H. F. Wilkins

Mediante esta técnica de difracción de rayos X se obtuvieron los siguientes resultados:

Difracción de Rayos X: ADN-B Rosalin Franklin

Basándose en estos dos tipos de datos Watson y Crick propusieron su Modelo de estructura para el ADN conocido con el nombre de Modelo de la Doble Hélice. Las características del Modelo de la Doble Hélice son las siguientes:

Módelo de la Doble hélice: ADN-B J. Watson y F. Crick
Par A-T Par G-C Pares A-T y G-C

Además, la estructura en doble hélice propuesta por Watson y Crick (1953) sugería varías propiedades importantes del material hereditario:

ALTERNATIVAS AL MODELO DE LA DOBLE HÉLICE

El modelo de la Doble Hélice propuesto por Watson y Crick está basado en estudios del ADN en disolución (hidratado). La denominada forma B ó ADN-B tiene un mayor interés biológico ya que es la que presenta el ADN en interacción con las proteínas nucleares. Además de la forma B, existen otras estructuras posibles que puede presentar el ADN. Algunas de estas alternativas son las siguientes:

ADN-A ADN-B ADN-Z ADN-A ADN-Z ADN-B
Triple hélice: pirimidinas Triple hélice: purinas Triple Hélice
Cuartetos de Guanina

Además, de las alternativas anteriormente citadas es necesario tener en cuenta que no todos los organismos vivos tienen como material hereditario ADN de doble hélice, algunos virus tienen ADN de hélice sencilla, ARN de una y de doble hélice.

Secuencias palindrómicas Palíndromos en ADN de una y doble hélice
ARN Fago MS2: proteína de la cápside
Esquema ARN-transferente Esquema ARN-ribosómico de Tetrahymena

PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Las principales propiedades físico-químicas de los ácidos nucleicos que vamos a considerar son las siguientes:

DENSIDAD DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Densidad: existe una relación lineal entre el contenido en G+C y la densidad del ADN determinada en un gradiente de densidad. A mayor contenido en G+C mayor densidad posee el ADN.

Cuanto mayor es el contenido en (G+C) mayor es la densidad.

Meselson y col. (1957) desarrollaron una técnica de centrifugación en gradiente de densidad. Cuando se centrifuga a alta velocidad un solución densa (saturada) de un soluto de bajo peso molecular (ClCs 7,7 M, sucrosa, etc.) se produce un equilibrio entre dos fuerzas opuestas, la de difusión del soluto y la fuerza de sedimentación, como consecuencia se produce un gradiente de densidad que aumenta en la dirección de la fuerza centrifuga (aumenta a medida que avanzamos hacia el fondo del tubo de centrifuga). Si añadimos al centrifugar una molécula de ADN, está migrará hacia el fondo del tubo hasta llegar al punto en que la densidad del soluto de bajo peso molecular (la densidad del ClCs) coincide con la densidad del ADN centrifugado (densidad de flotación). Posteriormente, es posible aislar las moléculas de ADN de diferente densidad practicando un orificio en el fondo del tubo y sacando varias fracciones diferentes. También es posible pinchar el tubo con una jeringa, justo en la posición de la banda y extraer el ADN contenido de esa zona del tubo. 

Centrifugación en gradiente de CsCl

Basándose en múltiples estudios de la densidad de los ADNs de diferentes organismos y de su composición en bases nitrogenadas, se ha establecido una fórmula empírica que relaciona la densidad de flotación (ρ) con el contenido en G+C expresado en moles por ciento. Está fórmula es la siguiente: ρ = 1,660 + 0,00098(G+C).  

DESNATURALIZACIÓN: TEMPERATURA DE FUSIÓN

Desnaturalización: la proporción A+T/C+G está relacionada en primer lugar con la estabilidad de la molécula de ADN de doble hélice. Cuanto mayor es el contenido en G+C de una molécula, mayor cantidad de pares G-C presentará, como consecuencia tendrá una mayor cantidad de triples enlaces y, por consiguiente, será necesario suministrar una mayor cantidad de energía a esa doble hélice para separar sus dos hebras (desnaturalización o fusión del ADN). Cuanto mayor es el contenido en G+C mayor cantidad de calor que hay que suministrar a un ADN de doble hélice para desnaturalizarlo. La temperatura de fusión (Tm) necesaria para desnaturalizar la mitad del ADN de una mezcla (punto medio de la reacción ADN doble hélice ® ADN hélice sencilla) esta directamente relacionada con el contenido en G+C, a mayor contenido en G+C mayor temperatura de fusión (Tm).

Relación entre el contenido en (G+C) y Tm Curvas de desnaturalización de diferentes ADNs

ABSORBANCIA A 260 nm

Absorbancia a 2.600 Å: El estado físico de los ácidos nucleicos está relacionado con su capacidad de absorción de la luz ultravioleta (UV) a 2.600 Å. El menor grado de absorción se produce en estado de doble hélice, la absorción aumenta cuando se produce la desnaturalización pasando a estado de hélice sencilla (efecto hipercrómico, aumento de la absorbancia) y, por último, si degradamos este ADN de hélice sencilla a nivel de nucleótidos libres, de nuevo aumenta la absorbancia.

Esquema efecto hipercrómico

Por tanto, la absorbancia a 2.600 Å se puede utilizar como una medida del estado físico de la molécula de ADN. Las curvas de fusión tienen forma de S observándose un aumento brusco de la absorbancia al llegar a una temperatura determinada, la temperatura de fusión.  

CINÉTICA DE RENATURALIZACIÓN: CURVAS CoT

Velocidad de renaturalización: la velocidad de renaturalización del ADN de un organismo está relacionada con su complejidad. La complejidad se define como la suma del número de nucleotidos que tiene cada tipo de secuencia sin tener en cuenta el número de veces que esta repetida. El ADN de los virus y las bacterias en su mayoría sólo tiene secuencias que están una sola vez en el genoma (secuencias únicas). Sin embargo, los organismo más complejos, como los eucariontes, presentan distintos tipos de secuencias en su genoma. Los eucariontes tienen secuencias únicas (SU), secuencias de bajo número de copias (SBNC, 2-10 copias), secuencias repetidas (SR, alrededor de 102 copias) y altamente repetidas (SAR, 103 a 106 copias).

Tipo de Secuencia Nº de repeticiones Nº de nucleótidos
A (SU) 1 5.700
B (SU) 1 7.530
C (SBNC) 4 3.720
D (SBNC) 6 4.350
E (SR) 200 500
F (SAR) 10.000 300
G (SAR) 1.000.000 200
Complejidad   22.300

Si imaginamos un organismo eucarionte con los tipos de secuencias indicados en la tabla anterior, su complejidad sería la suma del número de nucleótidos de cada tipo de secuencia (22.300) sin tener en cuenta el número de veces que está repetida cada una de ellas.

No es difícil imaginar que la velocidad de renaturalización del ADN (paso de dos hélices sencillas a una doble hélice) este relacionada con el número de veces que esta repetida una determinada secuencia.

Supongamos que tenemos dos organismos hipotéticos distintos, ambos con la misma cantidad de ADN (1.000.000 de pares de nucleótidos). El organismo A posee 1.000 secuencias únicas diferentes, cada una con una longitud media de 1.000  nucleótidos. El organismo B tiene una secuencia de 100 nucleótidos de longitud que está repetida 10.000 veces. Si extraemos el ADN de estos dos organismos por separado, lo desnaturalizamos y las piezas de ADN desnaturalizado de cada organismo se ponen en condiciones de renaturalizar (tamaño uniforme de los fragmentos de ADN, entre 250 y 450 pb, temperatura, condiciones iónicas, etc), es evidente que el ADN del organismo B renaturalizará mucho antes, más rápidamente, que el del organismo A, ya que es mucho más probable que la secuencia que está repetida 10.000 veces encuentre otra complementaria en el medio de reacción para formar la doble hélice.

Las curvas de renaturalización o curvas Cot, de organismos que carecen de secuencias repetidas como virus y bacterias, tienen forma de S, tienen un sólo punto de inflexión o punto medio de la reacción. Todas las secuencias son únicas y tienen la misma probabilidad de encontrar a su complementaria para formar la doble hélice.

Curvas Cot de virus y bacterias Curvas Cot de un eucarionte

Las curvas Cot de organismos eucariontes con diferentes tipos de secuencias, poseen varios puntos de inflexión. Cada uno de ellos correspondiente a un tipo de secuencias (únicas, moderadamente repetidas, y altamente repetidas).

Como en el caso de las curvas de fusión, también se utiliza como medida el punto medio de la reacción de renaturalización, es decir, el Cot ½ o tiempo al que se ha reasociado la mitad del ADN. El Cot ½ es directamente proporcional a la complejidad del ADN del organismo. Valores de Cot ½ bajos (10-4 a 10-1) corresponden a secuencias altamente repetidas, valores de Cot ½ comprendidos entre 10 y 102 corresponden a secuencias moderadamente repetidas y las secuencias únicas o de bajo número de copias dan lugar a valores de Cot ½ altos (mayores de 103) .

HIBRIDACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Las técnicas de desnaturalización y posterior renaturalización se utilizan para conseguir la hibridación de ácidos nucleicos, es decir, una vez separadas las dos hebras del ADN doble hélice, es posible volver a formar una doble hélice con una hebra de ADN que sea complementaria (hibridación de ADN con ADN) o volver a formar una doble hélice con un segmento de ARN que contenga la secuencia complementaria (hibridación de ADN con ARN).

Endonucleasas de restricción

Las técnicas de hibridación (desnaturalización y posterior renaturalización) permiten, por ejemplo, identificar el gen que ha dado lugar a un determinado ARN-mensajero. Si se aísla un mensajero determinado en una célula, es posible hibridar este ARN con el ADN de la célula previamente fragmentado mediante el uso de endonucleasas de restricción. 

Las endonucleasas de restricción de tipo II son enzimas que reconocen secuencias cortas de ADN (de 4 a 6 pares de bases) de tipo palindrómico y cortan por el interior de la secuencia diana a la misma altura en las dos hélices de ADN (corte simétrico) o a distinto nivel en cada hélice (corte asimétrico). 

Eco RI Hae III

Dichas endonucleasas de restricción fueron descubiertas por Werner Arber, Hamilton O. Smith y Daniel Nathans en la bacteria E.coli , trabajos por los que recibieron el premio Nobel. Estas enzimas forman parte del sistema de defensa (sistema de modificación-restricción) de las bacterias frente a la entrada de ADN exógeno en su interior. Existen cientos de endonucleasas diferentes que reconocen distintas secuencias cortas de tipo palíndrómico. En la siguiente tabla se indican algunas de las endonucleasas más frecuentes:

Endonucleasa de restricción

Bacteria de la que procede

Secuencia que reconoce (5' 3') y lugar de corte (¯)

Eco RI

Escherichia coli

5' G¯AATTC 3' (asimétrico)

Eco RII

Escherichia coli

5' ¯CCTGG 3' (asimétrico)

Hae III

Haemophilus aegyptus

5' GG¯CC 3' (simétrico)

Hin dII

Haemophilus influenzae

5' GTPi¯Pu AC 3' (simétrico)

Hin dIII

Haemophilus influenzae

5' A¯AGCTT 3' (asimétrico)

Hpa I

Haemophilus parainfluenzae

5' GTT¯AAC 3' (simétrico)

Hpa II

Haemophilus parainfluenzae

5' C¯CGG 3' (asimétrico)

Ava I

Anabaena variabilis

5' CGPu¯PiCG 3' (simétrico)

La utilización de diferentes endonucleasas y la separación por tamaños de los fragmentos producidos mediante electroforesis permite construir lo que se denomina Mapas de restricción.

Cuando el ADN de un organismo eucarionte se fragmenta con una endonucleasa de restricción, se producen cientos de miles o incluso hasta millones de fragmentos. Dichos fragmentos se separan por tamaños mediante electroforesis en geles de agarosa, una vez se parados por tamaños se transfieren los fragmentos a una membrana de nylon en condiciones desnaturalizantes y de forma que permanezcan en la misma posición. Los fragmentos desnaturalizados y pegados a la membrana se pueden renaturalizar o hibridar utilizando una segmento de ADN o de ARN (habitualmente denominado sonda) marcado radiactivamente. Dicha sonda, hibridará solamente con aquellos fragmentos de ADN que contengan la secuencia complementaria. La técnica que permite transferir los fragmentos de ADN desnaturalizados a una membrana de nylon y posteriormente hibridar con una sonda de ADN marcada se denomina Técnica Southern (hibridación ADN-ADN), cuando la hibridación se realiza con una sonda de ARN marcada se denomina Northern (hibridación ADN-ARN).

El empleo combinado de endonucleasas de restricción y de diferentes sondas de ADN de secuencia única marcadas permite obtener Polimorfismos para Longitudes de Fragmentos de Restricción (RFLPs), muy utilizados en la construcción de mapas de ligamiento.

Hibridación "in situ"

Las técnicas de hibridación "in situ" permiten localizar un segmento concreto de ADN (por ejemplo un gen) en una posición determinada de un cromosoma eucariótico. Es posible obtener preparaciones citológicas de cromosomas en metafase mitótica o en otras fases del ciclo, desnaturalizar el ADN de los cromosomas en la propia preparación citológica y posteriormente hibridar con la pieza de ADN deseada marcada. Actualmente, el marcaje suele ser de tipo fluorescente, denominándose dicha técnica Hibridación "in situ" mediante fluorescencia (abreviadamente FISH). También, es posible marcar todo el ADN de un genomio o juego de cromosomas completo y realizar una Hibridación "in situ" Genómica (abreviadamente GISH) que permite averiguar si los cromosomas de un determinado genomio están presentes. Otra aplicación, consiste en detectar determinados cromosomas o regiones cromosómicas concretas utilizando sondas o piezas de ADN marcadas mediante fluorescencia y procedentes solamente del cromosoma deseado, de esta manera, se obtiene lo que se denomina Pintura Cromosómica.

FISH trigo (Triticum intermedium) GISH: Híbrido (Liliaceae) Pintura cromosómica (ratón) Pintura cromosómica (humanos)

SECUENCIACIÓN DEL ADN: MÉTODO DIDESOXI Y MÉTODO AUTOMÁTICO

El análisis más detallado de la estructura del ADN consiste en averiguar la secuencia de nucleótidos. A lo largo del tiempo se han desarrollado diferentes métodos para obtener la secuencia de nucleótidos del ADN, sin embargo, actualmente los métodos más utilizados son el de secuenciación automática y el método enzimático de terminación de cadena de Sanger también conocido por el método didesoxi.

Método enzimático de terminación de cadena o método didesoxi de Sanger

Para obtener la secuencia de bases nitrogenadas de un segmento de ADN por el método enzimático de terminación de cadena, se necesitan los siguientes compuestos:

Breve descripción del método enzimático de terminación de cadena

Esquema de las electroforesis de las reacciones de secuenciación Autorradiografía

Breve descripción del método automático de secuenciación

El siguiente esquema representa de forma abreviada el método automático de secuenciación.

Esquema del método automático de secuenciación

En la siguiente figura se muestra un ejemplo de una secuencia obtenida por el método automático de secuenciación. Cuando aparece la letra N significa que no ha sido posible determinar el nucleótido existente en esa posición de la secuencia.

Secuencia obtenida  por métodos automáticos