PROCESOS GENÉTICOS DE LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS: LA TRANSCRIPCIÓN

       
Jacob Monod Cech Pribnow

FUNDAMENTO CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

La aceptación de la hipótesis de la secuencia propuesta por Crick (1958) significaba por un lado la existencia de un código o clave que permitiera pasar de un lenguaje escrito con cuatro letras (las cuatro bases nitrogenadas) en el ADN a un leguaje escrito con 20 letras (los aminoácidos) en las proteínas. Por otro lado, significaba la existencia de una serie de procesos que realizaran en la célula el trabajo de pasar de una estructura química como la de los ácidos nucleicos a una estructura química como la de las proteínas. Ya hemos visto en el capítulo anterior las características del código o clave genética y su desciframiento, ahora vamos a estudiar los procesos genéticos de la síntesis de proteínas.

Teniendo en cuenta que en las células eucariontes los cromosomas (material genético organizado) se encuentran en el núcleo y que la información que contienen los cromosomas (los genes) se expresa en el citoplasma, se supuso que tendría que haber alguna molécula intermediaria en el flujo de la información desde el ADN a las proteínas. Jacob y Monod en 1961 propusieron la Hipótesis del mensajero: "debe existir una molécula que transporte la información fielmente desde el ADN hasta las proteínas". En ese mismo año Brenner y colaboradores (1961) demostraron la existencia del este intermediario que resultó ser una molécula de ácido ribonucleico que se denominó ARN mensajero (ARN-m). Posteriormente, el ARN-m tenía que ser traducido a proteína.

Jacob Monod

Brenner

Basándose en estos trabajos Crick (1970) alumbró la idea de un sistema fundamental de mantenimiento y flujo de la información genética en los organismos vivos que denominó Dogma Central de la Biología Molecular. De manera que la información genética contenida en el ADN se mantiene mediante su capacidad de replicación. La información contenida en el ADN se expresa dando lugar a proteínas, mediante los procesos de transcripción, paso por el que la información se transfiere a una molécula de ARN mensajero (ARN-m) y, mediante el proceso de la traducción el mensaje transportado por el ARN-m se traduce a proteína.

F. Crick "Dogma Central de la Biología Molecular"

Este esquema central de flujo de la información pronto fue modificado, ya que en algunos virus cuyo material hereditario es ARN, la información se conserva o mantiene mediante replicación del ARN. Además, también se comprobó que la información no va siempre del ADN hacia el ARN (ADNARN), en algunos casos la información puede fluir del ARN hacia el ADN (ARNADN), es decir sintetizar ADN tomando como molde ARN , teniendo lugar el fenómeno de la transcripción inversa. H. Temin recibió el Premio Nobel en 1975 por sus descubrimientos en relación con la interacción entre los virus tumorales y el material genético en la célula, en particular por el descubrimiento de la transcripción inversa en virus ARN-ADN.

Temin Modificaciones del "Dogma Central de la Biología Molecular"

Por tal causa, en una ciencia como la Genética no debería emplearse la palabra "dogma" ya que como acabamos de ver en muy poco tiempo el fundamento central de la Biología Molecular propuesto por Crick tuvo que ser modificado.

TRANSCRIPCIÓN

La transcripción consiste en la síntesis de ARN tomando como molde ADN y significa el paso de la información contenida en el ADN hacia el ARN. La transferencia de la información del ADN hacia el ARN se realiza siguiendo las reglas de complementaridad de las bases nitrogenadas y es semejante al proceso de transcripción de textos, motivo por el que ha recibido este nombre. El ARN producto de la transcripción recibe el nombre de transcrito.

En las bacterias la transcripción y la traducción tienen lugar en el citoplasma bacteriano y al mismo tiempo, son simultáneas. Sin embargo, en eucariontes la transcripción tiene lugar en el núcleo y la traducción en el citoplasma.

Mediante experimentos de pulso y caza, se suministran precursores radiactivos que marcan específicamente el ARN (uridina tritiada) a las células durante un breve período de tiempo (pulso). Una vez que las células han incorporado la uridina tritiada se transfieren a un medio con precursores sin marcar (caza). De este forma es posible seguir el destino del ARN marcado durante el pulso, ya que la síntesis del nuevo ARN se produce con precursores sin marcar (uridina normal). Las muestras de células tomadas después de la caza, mostraban marcaje en el núcleo, indicando que ARN se sintetiza allí, sin embargo, las muestras de células tomadas después de la caza mostraban el marcaje radiactivo en el citoplasma. Por tanto, parece que el ARN se sintetiza en el núcleo y se transporta posteriormente al citoplasma.

Experimento de pulso y caza con precursores radiáctivos (uridina tritiada) Eucariontes: transcripción en el núcleo y traducción en el citoplasma

Volkin y Astrachan (1957) demostraron que después de la infección de E. coli por el fago T2 aumenta la síntesis de ARN y que este ARN inducido por la infección de T2 tiene una vida media muy corta. Infectaron bacterias con el fago T2 en un medio que contenía uridina tritiada, base nitrogenada específica del ARN (pulso), y después las pasaron a un medio con uridina normal no marcada (caza). El ARN recuperado después del pulso estaba marcado, pero el obtenido después de la caza no lo estaba, lo que indicaba que el ARN tenía una vida media muy corta. Por último cuando se comparó el porcentaje de los diferentes tipos de nucleótidos del ARN sintetizado inmediatamente después de la infección por T2 y del ADN del fago, se observó que era muy parecido, sugiriendo este resultado que el ARN sintetizado después de la infección por T2 procedía del ADN del fago.

LAS ARN POLIMERASAS Y LOS DISTINTOS TIPOS DE ARN

El ARN suele tener una sola hélice o cadena de nucleótidos pudiendo formar una amplia gama estructuras tridimensionales diferentes. El ARN contiene como azúcar a la ribosa y las bases nitrogenadas mayoritarias que posee son adenina (A), guanina (G), citosina (C) y uracilo (U). Por tanto, el uracilo (U) es característico del ARN. También se han encontrado bases poco frecuentes que forman parte del ARN, como son: la pseudouridina (ψ), metilguanosina (mG), dimetilguanosina (m2G), metilinosina (mI) y dihidrouridina (DHU, UH2).

En las células existen diferentes tipos de ARN. Por un lado están los ARN funcionales, o ARN que tienen una función o actividad en la célula y que no se traducen a proteína. Dentro de esta categoría están el ARN ribosómico (ARN-r) que forma parte de los ribosomas que intervienen en la traducción, los ARN transferentes (ARN-t) cuya función es transportar a los aminoácidos durante el proceso de traducción, los ARN nucleares pequeños (ARN-np) que interaccionan con proteínas formando los complejos de ribonucleoproteínas necesarios para el procesamiento de los transcritos en el núcleo y los ARN citoplásmicos pequeños (ARNcp) que intervienen en el trasporte de los polipéptidos en las células eucarióticas.

Por otro lado, están los ARN informativos que son los que se van a traducir a proteínas. Estos ARN informativos son los ARN mensajeros (ARN-m). En bacterias el transcrito primario, tal y como se sintetiza ya es el ARN-m maduro que se traduce a proteínas. En eucariontes, el ARN recién transcrito se denomina ARN heterogéneo nuclear (ARN-hn) y es un pre-ARN-m que es procesado antes de convertirse en el ARN-m maduro que posteriormente se traducirá a proteína.

En bacterias, existe solamente una ARN polimerasa que es capaz de sintetizar todos los tipos de ARN, el ribosómico, el transferente y los mensajeros.  La ARN polimerasa de E. coli está formada por varios polipéptidos, el núcleo central del enzima tiene dos cadenas de tipo α (peso molecular de 40.000), una β (peso molecular de 155.000) otra β' (peso molecular de 165.000). Además, la enzima completa u holoenzima tiene la subunidad σ o factor σ (peso molecular de 95.000)que es necesario para iniciar la transcripción. La subunidad σ una vez inciada la transcripción se libera y el núcleo central prosigue con la elongación del ARN.

ARN Polimerasa de E. coli: subunidades ARN-m policistrónico: operón lactosa

En bacterias, con mucha frecuencia, los ARN-m son poligénicos o policistrónicos, de manera que un solo ARN-m contiene información para la síntesis de varios polipéptidos distintos. Habitualmente se trata de genes que comparten un sistema común que controla su expresión (operón).

Sin embargo, en eucariontes hay diferentes polimerasas encargadas de sintetizar distintos tipos de ARN.

Las ARN polimerasas eucarióticas son bastante más complejas que las de E. coli, poseen subunidades semejantes o correspondientes a las de E. coli y otras que no lo son.

Las ARN polimerasas o trasncriptasas, a diferencia de lo que ocurre con las ADN polimerasas, carecen de función "correctora de pruebas". Esta diferencia se debe en primer lugar a que los transcritos son cortos y la probabilidad de que uno de los ARN posea una alteración es baja, y en segundo lugar a que la vida media de los ARN es corta y pronto se vuelve a sintetizar otro ARN nuevo. Por consiguiente el que exista un ARN con una alteración no es grave ya que durará poco y será remplazado pronto por otro nuevo sin la alteración. Sin embargo, un error en la replicación del ADN puede transmitirse a todas las células que deriven por división de la célula afectada.

En eucariontes los ARN-m son monogénicos o monocistrónicos, de manera que un ARN-m contiene información para sintetizar un solo polipéptido.

CARACTERÍSTICAS DE LA TRANSCRIPCIÓN: COMPLEMENTARIDAD, DIRECCIÓN Y ASIMETRÍA

Seguidamente vamos a ver las principales características de la transcripción.

Origen del ADN (A+T)/(G+C) del ADN (A+U)/(G+C) del ARN
Fago T2 1.84 1.86
Vaca 1.35 1.40
Micrococcus (bacteria) 0.39 0.49

En la siguiente figura, se ilustra que la secuencia de bases en el ARN es complementaria a la secuencia de la hélice codificadora e igual a la secuencia de la hélice estabilizadora, cambiando T por U.

La secuencia de bases del ARN es complementaria a la secuencia de la hélice codificadora

Otra manera de comprobar que existe complementaridad entre el ADN y el ARN es realizar experimentos de hibridación, de manera que el ADN se desnaturaliza y se mezcla con el ARN que se sintetiza en su presencia, cuando se lleva a cabo la renaturalización (mediante un enfriamiento lento), se producen híbridos ADN-ARN. Las moléculas híbridas ADN-ARN se pueden distinguir mediante centrifugación en gradiente de CsCl ya que presentan una densidad diferente a la de las dobles hélices ADN-ADN. La aparcición de moléculas híbridas ADN-ARN solo es posible si existen segmentos largos de complementarios, por tanto estos resultados indican que el transcrito es complementario del ADN parental.

Dirección y asimetría de la transcripción

Por ejemplo, Marmur y Greenspan (1963) comprobaron que en el fago SP8 que infecta a Bacillus subtilis, las dos hélices de su ADN se pueden separar mediante desnaturalización, enfriamiento rápido para mantenerlas separadas y posterior centrifugación en gradiente de densidad de CsCl. Por consiguiente, este virus posee una hélice ligera (L) y otra hélice pesada (H) con distinta relación de purinas/pirimidinas. Si se renaturaliza (enfriamiento lento) el ARN sintetizado después de la infección de B. subtillis por el virus y se hibrida por separado con el ADN de la hélice L y con el ADN de la hélice H, se puede comprobar que el ARN solamente híbrida con el ADN de la hélice H. Por tanto, en el virus SP8  todos los genes se transcriben utilizando como molde (hélice codificadora) la hélice H. La transcripción es asimétrica.

Hayashi y col. (1963) demostraron que el fago ØX174 cuyo material hereditario es ADN circular de una hélice, denominada hélice (+), cuando infecta a E. coli, pasa por una forma replicativa de doble hélice, la nueva hélice de ADN sintetizada después de la infección se la llama hélice (-). La hélice (-) sirve de molde durante las últimas etapas de la infección para producir mediante una replicación asimétrica nuevas hélices (+) del ADN del virus que se introducirán en el interior de las cápsides ya formadas. A su vez, comprobaron que el ARN que se sintetiza inmediatamente después de infectar a E. coli, solamente hibrida con el ADN de la hélice (-). Por consiguiente, todos los genes de este virus se transcriben utilizando como molde (hélice codificadora) la hélice (-). La transcripción es asimétrica.

Fago SP8 Fago ØX174

En otros fagos, como el bacteriofago T4, se ha comprobado que parte de los genes se transcriben a partir de una hélice y otro grupo de genes utiliza como codificadora a la otra cadena. Estos resultados se pueden explicar suponiendo que inicialmente todos los genes del fago se transcribían utilizando solamente una de las hélices y que posteriormente se produjo una inversión (se invierte el orden de un grupo de genes mediante dos giros perpendiculares de 180º, un giro que invierte la secuencia y otro giro perpendicular al anterior para mantener la polaridad de la hebras del ADN). Como consecuencia, después de la inversión el grupo de genes del segmento invertido utiliza como codificadora la otra hélice.

Inversión Situación en el fago T4

En los organismos eucariontes, para cada gen solamente se transcribe un hebra de ADN (la codificadora), de forma que genes distintos del mismo cromosoma pueden utilizar como codificadora una hélice diferente a la de otros genes.

INICIACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN

El inicio de la transcripción necesita que el factor σ esté unido al núcleo central de la ARN polimerasa. Existen unas secuencias de ADN específicas y necesarias para que la holoenzima  reconozca el lugar de comienzo de la transcripción, dichas secuencias específicas se denominan secuencias promotoras. Pribnow (1975) aisló y secuenció las regiones de ADN que quedaban protegidas por la ARN polimerasa después de someterlas a digestión con  ADNasa pancreática. Siguiendo este método se secuenciaron los primeros promotores de fagos como el T7 y l, y del promotor del operón lactosa.  Pribnow observó una secuencia de unos 7 pares de bases que se encontraba 10 bases antes de la primera que se transcribe y que aparecía en la mayoría de los fragmentos protegidos por la ARN polimerasa. Esta secuencia se la denominó Caja de Pribnow y es: 5' TATPuATPu 3'.

Secuencias promotoras consenso de E. coli y eucariontes Pribnow

Cuando se analizan las secuencias de las regiones anteriores a la primera base que se transcribe aparecen dos regiones cortas que muestran un parecido o similitud bastante grande, la primera región se encuentra 10 bases antes de la primera que se transcribe (Caja de Pribnow) y la segunda se localiza 35 bases antes. El estudio de muchas regiones promotoras de diferentes genes permite determinar las secuencias que aparecen con mayor frecuencia y establecer lo que se denomina las secuencias promotoras  consenso o ideales.

Los resultados obtenidos en E. coli después de analizar 100 regiones promotoras son los siguientes:

Secuencias consenso promotoras en E.coli

5' ....... T82T84G78A65C54a45 ................ T80A95t45A60a50T96 ...................CAT .............. 3'
5' .......              -35                    ................             -10                   ...................   1ª bases transcrita

El subíndice indica el porcentaje de aparición de la base más frecuente de esa posición. Si la letra es mayúscula  indica que el porcentaje de aparición es mayor del 54% y si es minúscula que es inferior al 54%.

El factor sigma es el responsable de que la ARN polimerasa reconozca estas secuencias y se una a ellas. La holoenzima recorre el ADN hasta encontrar las regiones -10 y -35 (secuencias promotoras) y se une a ellas, posteriormente comienza a separar las dos hélices por la región -10 (rica en pares AT). Cuando la holoenzima ha reconocido y separado las dos hélices se forma lo que se denomina "complejo abierto con el promotor".

Iniciación de la Transcripción Secuencias de regiones promotoras de E. coli

La actividad de los promotores puede modificarse por la presencia de otras secuencias estimuladoras o "enhancers" que aumentan la tasa de transcripción o por secuencias atenuadoras que disminuyen la tasa de trasncripción. Estas secuencias estimuladoras y/o atenuadoras suelen estar cerca de las promotoras pero no a una distancia fija de estas y pueden ejercer su función sobre varios promotores diferentes.

En eucariontes la iniciación de la transcripción es más compleja que la de E. coli y depende de la presencia de Factores proteicos de transcripción (TF). La mayoría de las secuencias promotoras eucarióticas se encuentran antes (o "aguas arriba") de la primera base transcrita, aunque algunos promotores de la ARN Pol III se localizan después de la primera base transcrita ("aguas abajo"). Los TF interaccionan con las ARN polimerasas para iniciar la transcripción, los promotores de la ARN pol II son los que muestran mayor variación en su secuencia, motivo por el que hay muchos TF diferentes que interaccionan con la ARN pol II para iniciar la transcripción. Existen tres tipos de Factores proteicos de transcripción (TF):

Los promotores que tienen secuencias que solamente son reconocidas por factores basales y factores que actúan aguas arriba, corresponden a genes que se expresan de manera constitutiva (se expresan siempre) en todos los tejidos. Se trata de los genes encargados del metabolismo básico de la célula involucrados en el buen funcionamiento celular. A estos genes se les ha denominado genes ("Housekeeping genes"), es decir, los genes que guardan o mantienen la casa.

Los promotores de la ARN pol I (transcribe los precursores del ARN ribosómico) tienen dos secuencias ricas en pares GC y que muestran una homología del 85%, una secuencia de 65 pb denominada núcleo que incluye la primera base que se transcribe (de -45 a +20) y una segunda secuencia unos 70 pb antes (aguas arriba) que actúa como elemento de control y que va desde la posición -107 a la -180.

Los promotores de la ARN pol III (transcriben ARN-t, ARN-5S y ARN de tamaño pequeño) contienen secuencias de reconocimiento situadas después de la primera base que se transcribe (aguas abajo), a este tipo de promotores se les denomina promotores internos (están dentro del gen). Se han encontrado en los promotores de ARN-t y ARN-5S pero no se han descrito en ARN de tamaño pequeño.

Los promotores de la ARN pol II son más variables que los de las ARN pol I y pol III pero a pesar de esta variación tienen una estructura general bastante conservada, de manera que se han reconocido al menos tres secuencias canónicas o consenso situadas en las regiones -25 (caja TATA, con la secuencia TATAAAA), -75 (caja CAAT con la secuencia GGCCAATCT) y -90 (caja GC con la secuencia GGGCGG). La caja TATA es equivalente a la caja de Pribnow de los promotores de bacterias y se la denomina caja de Hogness.

El punto de iniciación de la transcripción en eucariontes suele ser una adenina flanqueada por pirimidinas, aceptándose la existencia de una región iniciadora (Inr) con el siguiente tipo de secuencia: Pir-Pir-C-A-Pir-Pir-Pir-Pir-Pir.

Resumen de las secuencias consenso promotoras en eucariontes

5' .... GGGCGG ......... GGCCAATCT ...... TATAAAA ..... Pir-Pir-C-A-Pir-Pir-Pir-Pir-Pir ........ 3'
5' .....     -90        .........          -75            ......       -25        .....                   1ª bases transcrita

ELONGACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN

La elongación de la transcripción no necesita del factor σ, una vez iniciada la trasncripción el factor sigma se suelta y el núcleo central de la ARN polimerasa comienza a sinterizar el ARN  en la dirección 5' P 3'OH a partir de ribonucleósidos trifosfato libres que sirven de sustrato al enzima. Parece ser que se van produciendo desenrollamientos parciales del ADN de la región que se está transcribiendo y que la velocidad de transcripción en E. coli a 37º C es de 2500 ribonucleótidos por minuto (aproximadamente 42 ribonucleótidos por segundo).

TERMINACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN

La terminación de la transcripción en E. coli puede tener lugar por dos mecanismos distintos:

Secuencias terminadoras ricas en pares G-C que forman un lazo en horquilla, seguidas de 6 a 8 uracilos. Terminación dependiente de rho

En eucariontes la terminación de la transcripción es más compleja.

PROCESAMIENTO DEL ARN

Los ARN recién sintetizados suelen sufrir un procesamiento posterior. Por ejemplo, en bacterias, el ARN precursor del ARN ribosómico (ARN-r) es de mayor tamaño, sucediendo algo parecido con los ARN precursores de los ARN transferentes (ARN-t). Sin embargo, el ARN que se va a traducir a proteínas no sufre procesamiento alguno en bacterias, tal y como se sintetiza comienza a traducirse. De hecho, en bacterias la transcripción y la traducción son simultáneas (al mismo tiempo), es más, aún no ha terminado de transcribirse un ARN mensajero y ya se le han unido ribosomas que están traduciéndolo.

Visualización de la transcripción y la traducción en la bacteria E. coli Esquema de la transcripción y la traducción en la bacteria E. coli

El ARN precursor del ARN transferente de bacterias tiene una región "líder" por el extremo 5' y una "trailer" por el extremo 3' que desaparecen durante el procesamiento gracias a la acción de la ARNasa P y de la ARNasa Q. A veces se encuentra la información para dos ARN-t distintos en el mismo ARN precursor, existiendo entre ambos una región espaciadora que se transcribe, de forma que la estructura del ARN precurso es la siguiente: 5' Líder - ARN-t1 - Espaciador transcrito - ARN-t2 - Trailer 3'. Posteriormente, la ARNasa P y la ARNasa Q cortan el precursor  liberando los dos ARN transferentes.

El número de copias de genes de ADN-r (ADN ribosómico) en bacterias es bajo entre 5 y 10 copias. Cada gen de ADN-r posee un promotor y una región terminadora que da lugar tras la transcripción a un ARN precursor del ARN ribosómico (ARN-r) de mayor tamaño que el ARN-r maduro. EL ARN precursor tiene un coeficiente de sedimentación 30S e incluye información para el ARN 16S, una molécula de ARN-t, el ARN 23S y el ARN 5S. Este ARN precursor es cortado por la ARNasa III y una endonucleasa que generan tres piezas, una que contiene el precursor del ARN 16S (subunidad pequeña ribosoma) junto con un ARN-t, el ARN 23S (subunidad grande del ribosoma) y el ARN 5S (subunidad grande del ribosoma). Después actúa la ARNasa M que separa el ARN 16S del ARN-t.

Porcesamiento ARN-t de bacterias Procesamiento ARN-r de bacterias

 Los genes para el ARN ribosómico en eucariontes se encuentran repetidos en tandem del orden de cien veces en la región del organizador nucleolar (NOR). En el caso de la especie humana existen varios cromosomas con regiones organizadoras nucleolares, en particular, cinco pares de cromosomas, los pares 13, 14, 15, 21 y 22. En cada región NOR cada gen ADN-r tiene un promotor y un terminador y está separado del siguiente por una región espaciadora que no se transcribe. El ARN precursor (recién transcrito) del ARN ribosómico  tiene un coeficiente de sedimentación 45S y su estructura es la siguiente: 5' Líder- precursor del ARN 18S - Espaciador trasncrito - precursor del ARN 5,8S - Espaciador transcrito - precursor del ARN 28S 3'. Posteriormente, diferentes ARNasas y endonuclesas producen cortes en el ARN 45S que dan lugar al ARN 18S de la subunidad pequeña de los ribosomas y a los ARN 28S y 5,8S que forman parte de la subunidad grande de los ribosomas. Los genes para el ARN 5S de eucariontes se localizan en otra región diferente de los cromosomas eucarióticos.

 

Procesamiento ARN-r de eucariontes Genes para ADN-r de la región NOR

Sin embargo, en eucariontes además de sufrir procesamientos posteriores a la transcripción los ARN funcionales que van a dar lugar a los ARN-r y ARN-t, también sufren un procesamiento posterior a su transcripción los ARN informacionales que van a ser traducidos a polipéptidos. Este procesamiento consta de varios pasos y tiene como principal consecuencia la disminución del tamaño del ARN-hn (heterogéneo nuclear) recién transcrito por pérdida de varios segmentos del interior. Los principales pasos del procesamiento del ARN-hn son los siguientes:

En adenovirus se demostró por P. A. Sharp y R. J. Roberts (1977) que el ARN-m y el ADN del gen correspondiente no coincidían con exactitud al hibridar, de manera que aparecían lazos de ADN monocatenarios. Por tanto, había segmentos del ADN del gen que no estaban representados en el ARN-m maduro. Por consiguiente, los genes estaban fragmentados o en piezas. Por sus trabajos Sharp y Roberts recibieron el Premio Nobel en 1993. Posteriormente, se comprobó la estructura en Intrones y Exones (genes fragmentados) de los genes eucarióticos. La primera evidencia se obtuvo con los genes de la β-globina de conejo y de la ovoalbúmina de gallina. Los genes de la  β-globina de conejo y ratón tienen tres exones y dos intrones, mientras que el de la ovoalbumina de gallina tiene 7 intrones y 7 exones.

 
Esquema de procesamiento de un ARN-hn P. A. Sharp R. J. Roberts

A partir de eritrocitos de conejo se conseguió aislar el ARN mensajero maduro (ARN-m) que lleva información para la β-globina y el ARN recién transcrito o ARN heterogéneo nuclear (ARN-hn). También, fue posible aislar el segmento de ADN que lleva la información para la β-globina. Mediante la técnica de los “lazos R” desarrollada por White y Hogness (1977) es posible hibridar ARN con ADN de doble hélice a altas temperaturas y en presencia de formamida. En estas condiciones, los híbridos ADN-ARN son más estables que las moléculas de ADN doble hélice. Como consecuencia, el ARN hibrida con la secuencia complementaria de ADN y desplaza a la otra hélice de ADN que queda sin aparear formando un “lazo R”. Si se hibrida, por un lado, el ARN-m de la β-globina con el segmento de ADN que lo ha originado, y por otro, el ARN-hn (recién transcrito) de la β-globina con el segmento de ADN que lo originó y se analizan los resultados al microscopio electrónico, se obtienen la siguientes imágenes:

Los resultados obtenidos indicaban que hay una zona del ARN-m maduro que no hibrida con el ADN del gen de la β-globina ya que en el centro se observa la aparición de un lazo de ADN doble hélice y a ambos lados la existencia de dos lazos R. Sin embargo, el ARN-hn (recién transcrito) hibrida en toda su longitud con el ADN del gen de la β-globina sin que aparezcan en el centro zonas o lazos de ADN doble hélice. Por tanto, parece que la diferencia existente en el tamaño del ARN-hn y del ARN-m se debe a que existiría un procesamiento que eliminaría una parte del centro del ARN-hn. Estas regiones del ADN del gen de la β-globina que no se traducen en aminoácidos en la proteína recibieron el nombre de Intrones y aquellas que sí se traducen en aminoácidos son los Exones. En el siguiente esquema se da una interpretación a los resultados obtenidos cuando se hibrida el ARN-m con el ADN del gen de la β-globina.

Lazos R: gen de la β-globina de conejo Procesamiento del ARNhn de la ovoalbumina

El gen de la seroalbúmina de rata tiene 14 exones y 13 intrones y el factor VIII de coagulación humano posee 26 exones. El gen de la ovoalbumina de gallina tiene 7700 pares de bases entre la región líder, los siete intrones (1 al 7) y los siete exones (A al G) que posee. El ARN-m tiene 1872 nucleótidos, el resto hasta los 7.700 pares de bases se retira durante el procesamiento. El tamaño de los intrones de este gen varia desde los 251 pb del intrón B hasta los 1600 pb del intrón G.

Hibridación del ADN del gen de la ovoalbumina con el ARN mensajero maduro (ARN-m)

Hibridación del gen de la ovoalbumina Gen ovoalbumina: 7 intrones y 7 exones

En el gen del factor VIII de coagulación humano el tamaño de los exones varía entre 69 y 3106 pb y posee intrones de hasta 32.400 pb. El número de intrones y exones y su tamaño es muy variable de unos genes a otros dentro de la misma especie. El número de genes que poseen un solo intrón varía mucho de unas especies a otras, en Levadura (Saccharomyces cerevisiae) es el 95%, en D. melanogaster el 17% y en mamíferos el 6%.

También se han detectado intrones en los genes que codifican para el ARN-r, por ejemplo en el ARN 28S en D. melanogaster . Igualmente, en ARN-t de Tyr en levadura se ha detectado un intrón de 14 bases justo antes del extremo 3' del triplete del anticodón. Posteriormente se han detectado intrones en posiciones semejantes en otros ARN-t (ser, phe, leu, etc).

La eliminación de los intrones se lleva a cabo mediante un mecanismo de corte en las regiones de paso de exón a intrón y de intrón a exón para eliminar los intrones y de unión posterior de los exones sucesivos. Este mecanismo de corte y unión ha recibido el nombre de "splicing" en inglés. Cuando se analizan las secuencias de las regiones de paso de intrón a exón y de exón a intrón se encuentra unas secuencias bastante conservadas, en casi todos los casos aparece la secuencia GU en el punto de corte 5' del intrón y AG en el punto de corte 3'. Estas secuencias son reconocidas por moléculas de ARN nucleares pequeñas (ARNnp) que interaccionan con proteínas formando partículas ribonucleoproteicas pequeñas que constituyen lo que se ha denominado el "espliceosoma".

Secuencias consenso exón-intrón-exón Espliceosoma

Las reacciones de corte y empalme  en las que se elimina el intrón y se unen los exones consecutivos son dos reacciones transesterificación, estas reacciones consisten en el intercambio de un enlace fosfidiéster por otro, dando como resultado la unión de dos exones consecutivos.

PROCESAMIENTO ALTERNATIVO

También se ha observado que en diferentes tejidos de un mismo individuo o en el mismo tejido en diferentes momentos del desarrollo se pueden producir procesamientos distintos del mismo ARNhn, como consecuencia en cada tejido o momento del desarrollo se produce un ARN-m maduro diferente que da lugar a una polipéptido distinto. Un ejemplo de procesamiento alternativo es lo que sucede en el tiroides y en el hipotálamo en los que el mismo ARNhn da lugar con procesamientos diferentes al péptido de calcitonina en el tiroides y al péptido CGRP en el hipotálamo. Otro ejemplo de procesamiento alternativo es el caso del transcrito primario del gen de la α-tropomiosina en músculo estriado, músculo liso, cerebro y fibroblasto. En los dos ejemplos citados de procesamiento alternativo se mantiene el orden relativo de los exones.

Procesamiento alternativo calcitonina y CGRP Procesamiento alternativo α-tropomiosina

AUTOPROCESAMIENTO

Existen muchos ejemplos de moléculas de ARN que pueden realizar el autoprocesmiento de sus intrones sin necesidad de la ayuda de proteínas. Estas moléculas de ARN que pueden actuar como una enzima con propiedades catalíticas se han denominado ribozimas. Esta capacidad de autoprocesamiento de algunos moléculas de ARN fue descubierta por Cech y colaboradores en 1981 estudiando el ARN 35S precursor del ARN-r 26S de Tetrahymena thermophila (ciliado). La molécula del ARN-r 26S contiene un intrón de 400 bases que se autoprocesa. T. Cech recibió en 1989 el Premio Nobel por el descubrimientos de los ARN con propiedades catalíticas.

Autoprocesamiento de un intrón T. Cech

Existen dos tipos de intrones que se autoprocesan, los del grupo I en los que el producto de eliminación del intrón es una molécula lineal y los del grupo II en los que el producto de eliminación del intrón es una molécula en forma de lazo. En el grupo I se encuentran los transcritos primarios de algunos virus que infectan a E. coli, los transcritos primarios de Tetrahymena, en  mitocondrias y cloroplastos, y en algunos ARN-t primarios de bacterias. En el grupo II se encuentran algunos ARN-t primarios y algunos transcritos primarios de mitocondrias y cloroplastos.

EDICIÓN O CORRECCIÓN DEL ARN

Cuando se estudió la secuencia de bases del ARN-m de cox II que codifica para la subunidad II de la citocromo c oxidasa mitocondrial del Tripanosoma brucei encontraron que en la posición 520 había cuatro uracilos que no se encontraban presenten en la secuencia de bases del gen. Por tanto, estos cuatro uracilos habían sido añadidos después de la trasncripción (Benne y col. 1986).

La edición o corrección de los ARN se ha descrito en diferentes especies (protozoos, hongos, plantas y mamíferos), en orgánulos (mitocondrias y cloroplatos) y en el núcleo. Además se produce tanto en regiones codificantes (exones) como no codificantes (intrones). La corrección o edición del ARN puede producirse por adición de bases nitrogenadas, pérdida de bases nitrogenadas o por sustitución de bases después de la transcripción.