Cuadro de texto: Cuadro de texto:

Página principal

¿Quienes somos?

Enlaces

Publicaciones

Pruebas de paternidad

ADN antiguo

Tablón de anuncios

Cursos Novedades

Cómo llegar

Contáctanos

 

 

¿Qué es el ADN antiguo? Problemática

Técnicas de análisis

Aplicaciones El laboratorio Equipo investigador

 

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA "pcr"


 

El desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en 1985 (SAIKI et al. 1985; MULLIS y FALOONA 1987) supuso una auténtica revolución dentro del campo del ADN antiguo, al posibilitar la obtención de millones de copias a partir de cantidades ínfimas y muy fragmentadas de DNA original.

Podríamos decir que la técnica de la PCR permite seleccionar la región del genoma que se desea estudiar y realizar múltiples copias de la misma. Para ello, se prepara una reacción (mezcla de PCR o "mix") que contiene todos los elementos necesarios para producir una síntesis "in vitro" de ADN:

 

- Tampón de PCR (PCR buffer). Contiene sales que estabilizan el pH de la reacción.

- Cloruro de Magnesio (MgCl2).Forma complejos solubles con los dNTPs para producir un substrato reconocible por la polimerasa.

- Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs: dATP, dTTP/dUTP, dCTP,dGTP). Constituyen el sustrato con el que la ADN polimerasa construye la nueva cadena de ADN.

- Una pareja de cebadores ("primers"). Secuencias cortas de ADN complementarias a ambos extremos de la región de ADN que se desea copiar.

- Taq polimerasa. Enzima encargada del copiado de las cadenas a partir de los cebadores. Se trata de una DNA polimerasa purificada de la bacteria termófila "Thermus aquaticus", y que por lo tanto es estable a temperaturas superiores a los 90ºC.

 

Una vez preparada la reacción de PCR y añadido el ADN que se desea copiar, ésta se somete a varios ciclos en los que se varía la temperatura. Cada uno de dichos ciclos consta normalmente de tres pasos a diferentes temperaturas:

 

94ºC- Fase de desnaturalización. Se produce la separación de las dos hebras del ADN.

50-60ºC- Fase de anillamiento (annealing). Se produce la unión de los cebadores a la hebra correspondiente de ADN.

72ºC- Fase de extensión. La ADN polimerasa comienza a añadir nucleótidos por el extremo 3' de cada uno de los cebadores de amplificación, reproduciendo la secuencia del ADN molde.

 

 

MARCADORES M0LECULARES


 

ADN mitocondrial

El ADN mitocondrial (mtDNA) es un material genético circular cerrado de doble cadena que se localiza en el interior de las mitocondrias celulares.

El ADN mitocondrial se hereda por vía materna, es decir, aunque tanto hombres como mujeres tienen ADN mitocondrial, únicamente éstas últimas lo transmiten a su descendencia. Ello se debe a que durante la fecundación es el óvulo el que aporta el citoplasma al zigoto, y es en el citoplasma dónde se localizan las mitocondrias.

El genoma mitocondrial consta de aproximadamente 16500 pares de bases (p.b.), y codifica para una pequeña fracción de las proteínas mitocondriales. El mtDNA contiene información de 38 genes: 2rRNA (12S y 16S), 22tRNA y 13 genes estructurales, los cuales codifican diferentes subunidades de los complejos enzimáticos del sistema de fosforilación oxidativa.

La región mayor no codificante, conocida como región control o D-Loop, ocupa 1122 pares de bases. Esta región destaca por su elevada tasa de mutación y por ser muy variable entre las diferentes poblaciones. La variabilidad en la región control se concentra básicamente en tres regiones o segmentos hipervariables:

- HVSI (posiciones 16024-16365)

- HVSII (posiciones 73-340)

- HVSIII (posiciones 438-574)

De las tres, la más polimórfica es la HVSI, por lo que es la que se analiza principalmente en estudios de Antropología, Genética de Poblaciones y Medicina Forense.

El estudio del ADN mitocondrial resulta especialmente recomendado cuando se trabaja con muestras muy degradadas, como es de esperar en ADN antiguo. Se calcula que una célula puede contener hasta un centenar de mitocondrias, y que dentro de cada mitocondria coexisten entre 1000 y 10000 copias de ADN mitocondrial. Este elevado número de moléculas de ADN mitocondrial en la célula hace que su recuperación en aquellos casos en los que el ADN de partida es muy escaso o está muy degradado, sea mucho más eficiente que, por ejemplo, la de ADN nuclear o autosómico. 

 

Cromosoma Y

 

En la especie humana, el sexo viene determinado por el tipo de cromosomas sexuales presentes en las células (cromosomas X e Y). Así, el sexo femenino viene definido por dos cromosomas X (XX) y el masculino por un cromosoma X y un cromosoma Y (XY).

A excepción de dos pequeñas regiones situadas en los extremos en las que existe cierto grado de recombinación con  el cromosoma X, el cromosoma Y se transmite como una unidad íntegra de padres a hijos varones. Esta característica hace que, al igual que el ADN mitocondrial para las mujeres, pueda seguirse una determinada variante o haplotipo en sucesivas generaciones.

El Cromosoma Y se analiza de forma rutinaria en el campo de la Genética de Poblaciones y la Genética Forense. Sin embargo, su empleo en estudios de ADN antiguo es todavía muy restringido por motivos técnicos que tienen que ver con su escasez, dado que únicamente existe una copia de cromosoma Y por célula.

 

 

 

 

 

 

Marcadores autosómicos

 

Como autosomas se conocen todos los cromosomas excepto los cromosomas sexuales: X e Y.

El estudio de marcadores autosómicos se emplea esencialmente en el campo de la Genética Forense con fines identificativos, dada su elevada variabilidad.

En el caso del ADN antiguo, tal y como sucedía con el Cromosoma Y, la escasez de este tipo de material genético hace en muchos casos inviable su análisis. Sin embargo existen excepciones, y en algunos casos ha sido posible recuperar información de este tipo de restos antiguos procedentes de entornos fríos.

Cuadro de texto: ADN ANTIGUO