NÓMADAS · REVISTA CRÍTICA DE CIENCIAS SOCIALES Y JURÍDICAS
THEORIA UCM  ·  UNIVERSIDAD COMPLUTENSE  ·  ISSN 1578-6730


Identificación de nuevas funciónes biologicas del extracto dializable leucocitario de impacto en la terapéutica de enfermedades infecciosas e inflamatorias

Celia Fernández Ortega, Manuel de J Arana, Miriam Ojeda, Marta Dubet, Ignacio Ruibal, Olga L Vilarubia, Juan C Menéndez de San Pedro y Lourdes Navea
Centro de Investigaciónes Biológicas, La Habana, Cuba
Laboratorio Naciónal de Referencia del SIDA, La Habana, Cuba

Introducción

En los ultimos años, la inmunoestimulación no específica ha progresado desde el empleo de mezclas microbianas crudas y extractos hasta estrategias más sofisticadas que utilizan una larga colección de compuestos farmacologicamente activos. El factor de transferencia (FT) es una preparación con demostrados efectos sobre el sistema inmune. Es un material dializable de bajo peso molécular no inmunogénico, obtenido de leucocitos humanos de sangre periférica, que posee la capacidad de transferir inmunidad mediada por células (1). A pesar del empleo indistinto de los términos FT y EDL, el FT define realmente a los componentes del EDL que median respuestas T de naturaleza antígeno específica (2). Esta fracción contiene múltiples factores que parecen corresponder a la sumatoria de la experiencia inmune de un individuo particular.

El EDL ha sido ampliamente utilizado en la práctica clínica. Sin embargo, los mecanismos de acción farmacológica descritos respaldan sólo parcialmente algunas de las respuestas terapéuticas observadas, especialmente, cuando su uso está dirigido a entidades en las que desempeñan un papel patológico mecanismos que no son corregibles con la potenciación de la respuesta inmune afectada solamente. Este trabajo recoge la descripción de dos nuevas actividades biológicas del extracto dializable leucocitario (EDL): la inhibición de la producción de factor de necrosis tumoral (TNF) por leucocitos humanos activados y la inhibición de la replicación del VIH. Estos efectos del EDL tienen particular relevancia por su repercusión terapéutica y su valor analítico.

Resultados y Discusión
Inhibición de la producción del TNF

La producción descontrolada o la superproducción de citocinas constituye un mecanismo patogénico fundamental en respuestas inflamatorias sistémicas desencadenadas por el LPS de bacterias Gram negativas. Eventos tempranos asociados con respuestas perjudiciales a la endotoxina son atribuidos a una secreción descontrolada de TNF por monocitos y macrófagos activados, así como por otras células. Los monocitos humanos son extremadamente sensibles al LPS y niveles tan bajos como 10 pg/mL pueden inducir rápidamente la síntesis de citocinas inflamatorias como TNFα e interleuquina 1β (3).

Demostramos en nuestro estudio que el EDL no afecta la citotoxicidad mediada por TNF, pero si reduce significativamente la secreción estimulada por LPS de la proteína biologicamente activa. El efecto inhibitorio del EDL se observo tanto en cultivos de células monociticas aisladas, como en experimentos con sangre total (Figura 1).

Efecto inhibitorio del EDL en la liberación de TNF inducida por LPS en sangre humana total. A) 500 ul de sangre total se trataron simultáneamente con LPS (2 ng/mL) y dos concentraciones de EDL (0,125 y 2 U/mL) o B) se estimuló con LPS (2 y 20 ng/mL) 2 h después del tratamiento con diversas dosis de EDL (0,125-2 U/mL). Fueron también incluídos controles de inducción máxima (solo LPS) y de inducción basal (ausencia de LPS). Los sobrenadantes se colectaron a las 4 h y se cuantificó en ellos TNF utilizando un ELISA específico. El resultado mostrado es represenativo de 6 experimentos diferentes usando sangre de voluntarios sanos. Los niveles de producción de TNF en presencia de LPS y polimixin B (25 ug/mL) fueron de 375 pg/mL y 398 pg/mL en A y B, respectivamente (control positivo de inhibición).

El extracto de leucocitos fue capaz de disminuir los niveles de TNF secretados y cuantificados al transcurrir un periodo de 5,5 h después de iniciada la inducción con LPS en dosis elevadas. La inhibición provocada por el EDL en ausencia de proteínas séricas no fue revertida por la presencia de concentraciónes más elevadas de LPS. Por consiguiente, la secreción disminuida de TNF mediada por EDL no parece ser dependiente de moléculas competidoras con el LPS por sitios de reconocimiento específico sobre la superficie célular. Es ampliamente aceptado que la activación de leucocitos mediada por LPS ocurre principalmente como resultado de la interacción de un complejo formado por la endotoxina y la proteína LBP (o el LPS acomplejado a otras proteínas) con la molécula de superficie CD14, que se expresa en monocitos, macrofagos (4) y leucocitos polimorfonucleares (3,5). Mientras que esta vía dependiente de CD14 es predominante a bajas concentraciones de LPS, en presencia de concentraciones elevadas de LPS y en ausencia de proteínas séricas accesorias, parece predominar una vía independiente de CD14 (6). En nuestros experimentos, realizados en ausencia de suero, es probable que la activación ocurra primariamente a través del segundo mecanismo, aunque no deben descartarse eventos menores de estimulación a través de la interacción directa entre CD14 y el LPS o, inclusive, la presencia de cantidades residuales de proteínas séricas accesorias absorbidas. De esta manera, nuestras observaciones relacionadas con una inhibición significativa en condiciónes de ausencia de suero, no parece involucrar mecanismos mediados por LBP, septinas o la molécula CD14 soluble.

Es notable que el EDL adicionado al cultivo de monocitos 1 h después de iniciada la estimulación con LPS, inhibe la liberación de TNF a niveles similares a aquellos obtenidos bajo condiciones de incubación simultánea. Ésta resulta una importante clave para la aplicación terapéutica del EDL en procesos inflamatorios agudos y crónicos asociados a la liberación de citocinas proinflamatorias.

Nuestros resultados indican que el tratamiento con EDL afecta más bien mecanismos postraducciónales dependientes de LPS, pero no debe descartarse la posible influencia del extracto sobre la regulación de la transcripción génica. Otros investigadores han reportado la inhibición de la expresión de esta citoquina mediante el bloqueo de vías que involucren segundos mensajeros (7), las cuales no sólo conducen a una rápida acumulación de ARNm de TNFα, sino también a una acelerada producción de TNFα (8).

En nuestro trabajo evaluamos el efecto del EDL en ensayos con sangre total. El tratamiento simultáneo in vitro de los leucocitos humanos con EDL y LPS reduce potentemente la producción de TNF, evaluada 4 h después de iniciada la inducción con la endotoxina (Figura 1A). En efecto, la presencia de altas dosis de EDL bloquea la secreción de TNF inducida por la endotoxina y solamente se observa un ligero incremento sobre los niveles basales de la citocina en leucocitos tratados con pequeñas dosis del extracto. Esta potente respuesta inhibitoria, obtenida en un sistema que mimetiza condiciónes fisiológicas, enfatiza el potencial terapéutico de este producto en enfermedades inflamatorias asociadas al LPS. La reducción de la producción de TNF en presencia de pequeñas dosis de LPS, parece indicar que el tratamiento de las células con EDL afecta la secreción de citocinas estimulada por LPS dependiente de CD14, o que un evento común desencadenado por la interacción del LPS con la molécula CD14 u otro receptor de superficie célular, son los blancos de la acción inhibitoria del EDL. El ensayo en sangre total, incluidas las células polimorfonucleares que producen TNF en respuesta al LPS (9), demuestra que el EDL afecta la respuesta de diferentes tipos celulares.

Se ha demostrado que la producción de TNF inducida por LPS tiene un papel importante en el síndrome séptico. Dadas las observaciónes realizadas en este estudio relaciónadas con la capacidad del EDL de suprimir la secreción de TNF inducida por LPS y de reducir substancialmente la producción de TNF por células previamente activadas (Figura 1B), se sustenta la evaluación terapéutica de EDL en síndromes de respuesta inflamatoria generalizada. En pacientes con sepsis, se han reportado concentraciónes reducidas de proteína C reactiva luego del tratamiento con EDL (10). Esta respuesta in vivo puede ser dependiente del control de la secreción de TNF. Los resultados de este estudio también tienen particular relevancia para el tratamiento de otras enfermedades en las cuales la secreción de TNF, y de otras citocinas y mediadores inducidos por TNF, desempeñan un papel patogénico, como son el asma bronquial, la artritis reumatoide, el SIDA y la esquistosomiasis. Vale destacar que estas entidades también cursan con defectos en la respuesta inmune que pueden ser corregibles bajo los efectos inmunomoduladores del EDL.

Inhibición de la replicación del VIH

Desde el descubrimiento del VIH como agente causal del SIDA, han sido descritos diferentes compuestos con actividad anti-retroviral in vitro y alguno de ellos son comúnmente utilizados en el tratamiento de la infección por VIH. Estas terapias anti-retrovirales ofrecen diferentes beneficios clínicos, como la disminución de la velocidad de aparición de infecciónes oportunistas y prolonga la sobrevida, pero estos agentes son incapaces de detener la progresión de la infección viral. La mejoría inmunológica lograda es incompleta, y por otra parte, algunos de los actuales agentes terapéuticos son tóxicos para las células del sistema inmune (11). Recientemente, la inmunoterapia ha prestado especial atención a la búsqueda de estrategias dirigidas contra el VIH. La terapia de combinación que involucra el uso de agentes anti-retrovirales y compuestos inmunoterapéuticos parece ser prometedora.

En este estudio, se demostró la capacidad del EDL de reducir la producción viral en dependencia de la dosis en un modelo in vitro de infección por VIH. Este efecto se observo al tratar el cultivo célular con EDL durante 7 días antes del enfrentamiento con el virus (Figura 2). No se modificó la producción del VIH transcurrido un periodo de tratamiento breve (3 h) con el extracto.

Efecto del EDL sobre la infección por VIH de células MT-4. Las células (2,5 x 105 cel/mL) fueron pre-tratadas durante 7 días usando diferentes concentraciónes de EDL, y entonces retadas con VIH-Bru a una dosis viral de 0.05 (A) o 0.1 (B) m.o.i. Medio fresco con EDL fue adicionado después de la infección y sustituido nuevamente a los 3 días de cultivo. Los sobrenadantes se colectaron a los 7 días del reto viral y se determinó en ellos antígeno p24 antigen por ELISA (DAVIH).

A partir de una cromatografía de exclusión molecular, se logró obtener una fracción aislada (Fb) con actividad inhibitoria de la producción del VIH (Figura 3). Ésta es una fracción heterogénea en cuanto a su composición y se realizan estudios adiciónales que permitan definir los componentes moleculares que median este efecto. El efecto inhibitorio de la fracción Fb también fue evidenciado transcurridos 7 días de pre-tratamiento de las células MT-4.

Efecto de fracciónes del EDL sobre la infección por VIH de células MT-4. Las células (2,5 x 105 cel/mL) fueron pre-tratadas durante 7 días usando diferentes concentraciónes de cada fracción (Fa, Fb, Fc). Para el resto se usaron dosis virales del aislamiento VIH-Bru de 0,5 (A) o 1 (B) m.o.i. Los cultivos se mantuvieron y procesaron como se explicó en la Figura 2.

Probablemente, se requieren efectos acumulativos o prolongados para reducir la sensibilidad de las células a la infección por VIH o para lograr una afectación parcial de la expresión viral. Deben explorarse posibles mecanismos relaciónados con la actividad moduladora del EDL sobre la expresión de diferentes citocinas. Otros estudios refieren la participación de redes de citocinas en el control de la expresión del VIH (12-14).

En este estudio, se utilizó como modelo experimental la linea célular MT-4, células linfoblastoides CD4+ infectadas con HTLV-1 altamente sensibles al VIH (15). Se ha reportado la producción endógena de TNFα por células linfoblastoides y una reducción de la sensibilidad de estas células a la infección por VIH al ser tratadas con anticuerpos específicos anti-TNFα (16, 17). La capacidad que tiene el EDL de reducir la producción de TNF en monocitos activados con LPS, probablemente ejerce su efecto a nivel postranscripciónal. A pesar de las diferencias entre ambos modelos experimentales, el EDL podria mediar efectos inhibitorios similares sobre la liberación de TNF por la línea célular MT-4, que afectan indirectamente la expresión del VIH. Por otra parte, deben evaluarse otros efectos moduladores de este extracto sobre distintas citocinas reguladoras de la expresión del VIH, además de sobre eventos a nivel membranario que median la infección viral.

Estos resultados, obtenidos en sistemas in vitro utilizando una línea célular, indudablemente contribuyen a dilucidar los mecanismos involucrados en las interacciónes célula-virus y permiten establecer un enfoque racional del uso terapéutico del EDL en la infección por VIH. Se ha demostrado una mejoria de la respuesta inmune en pacientes tratados con EDL (18). Esos resultados clínicos, conjuntamente con los del presente estudio, indican la regulación por el EDL de la replicación viral en un sistema in vitro y reafirman la importancia de continuar los estudios de caracterización del EDL y de instaurar su empleo de modo definitivo en la búsqueda de una terapéutica efectiva del SIDA.

Referencias

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